现代核磁共振实验方法：从一维到多维谱图解析

现代核磁共振（NMR）技术早已超越了早期测量连续微波吸收的范畴。如今，我们通过探测自旋体系对一系列精心设计的微波脉冲序列的响应，并对采集到的振荡电流信号（即自由感应衰减，FID）进行傅里叶变换，从而获得高分辨率的核磁共振谱图。

旋转坐标系下的矢量模型：一个直观的视角

为了精准操控和解读自旋行为，我们引入了旋转坐标系（Rotating Frame）这一强大的理论工具。在实验中，除了沿 ξ 轴施加一个强大的静态主磁场 B₀ 外，我们还会通过一个发射线圈，在垂直于 ξ 轴的 Χ 轴方向上，施加一个强度为 2B₁、角频率为 ω 的交变磁场。这个交变场可以分解为两个强度为 B₁、方向相反的圆周旋转磁场。

其中一个旋转磁场 B₁ 会对自旋产生两个关键效应：一是迫使原本各自进动的自旋实现同步；二是将它们的宏观磁化矢量从 ξ 轴（Z 轴）方向上“推”开。如果我们建立一个与该 B₁ 场以相同角频率 ω 围绕 ξ 轴旋转的坐标系（O-x’y’z’），那么在这个新坐标系中观察，自旋感受到的有效磁场将大大简化。它由两个恒定分量构成：一个沿 x’ 轴方向的静态场 B₁，以及一个沿 ξ 轴方向的恒定场 B₀ - ω/γ_n（其中 γ_n 是磁旋比）。

当施加的旋转场频率 ω 恰好满足共振条件，即 ω = ω_L = γ_nB₀ 时，沿 ξ 轴的有效磁场分量 B₀ - ω/γ_n 恰好为零。此时，在旋转坐标系中，自旋感受到的唯一磁场就是沿 x’ 轴的 B₁ 场。这个恒定的 B₁ 场会驱动宏观磁化矢量围绕 x’ 轴以一个较小的角频率 γ_nB₁ 进行旋转。这种将复杂的进动问题简化为简单旋转的矢量模型，为我们直观理解各种脉冲序列的效应提供了极大的便利。

图1. 用于阐释核欧豪瑟效应（NOE）的能级图。NOE发生在空间上邻近的原子核之间。

高分辨率核磁共振：追求极致的分辨率

在NMR谱图中，化学位移的绝对大小与外磁场 B₀ 的强度成正比，而由 J-耦合产生的精细结构（裂分）大小则固定不变。这意味着，使用更高场强的磁体，可以有效“拉开”化学位移差异极小的重叠信号，从而显著提升谱图的分辨率（见图2）。对于蛋白质等生物大分子而言，其NMR谱通常表现出严重的信号重叠，因此提高分辨率是谱图解析的先决条件。目前，研究人员普遍采用超导磁体来获得极高的磁场强度，其场强通常以等效的 ¹H 共振频率来衡量，例如高达 800 MHz 甚至更高。

图2. 化学位移 Δδ 随磁场增强而增大，而自旋-自旋耦合常数 J₁ 和 J₂ 保持不变。使用高场强可有效提升NMR的分辨率。

一维核磁共振（1D-NMR）技术

现代NMR技术的核心任务之一，就是无失真地分离如图3所示的复杂信号。除了采用高场磁体，设计精巧的一维脉冲序列也是解决问题的关键。

图3. 环状-GRGDSPA多肽的NMR谱图，展示了化学位移与J-耦合。

自由感应衰减（FID）

最基础的脉冲NMR实验可以用矢量模型清晰地展示（见图4）。

1. 初始态：在平衡状态下，宏观磁化矢量沿着 ξ 轴（Z 轴）排列（图4a）。
2. 脉冲激发：施加一个持续时间为 Δt 的旋转场 B₁，其频率为参考频率 ω。当满足 γ_nB₁Δt = π/2 时，这个所谓的“90度脉冲”会将磁化矢量精确地翻转到 y’ 轴上（图4b）。
3. 自由进动与检测：关闭旋转场 B₁ 后，处于 y’ 轴上的相干磁化矢量开始在实验室坐标系中以其固有的拉莫尔频率 ω_r 自由进动。这个进动的磁矩会在接收线圈中感应出一个振荡电流，该信号会因弛豫过程而衰减，这便是自由感应衰减（FID）信号（图4d）。

图4. (a)-© 旋转坐标系中矢量模型的磁化响应；(d) 自由感应衰减（FID）信号。

对这个FID信号进行傅里叶变换，即可得到频域的NMR谱图。如果样品中只有一种原子核，其谱图将是在其拉莫尔频率处的一个单峰（图5a）。

图5. (a, b) 从FID曲线（左）经傅里叶变换得到的NMR谱图（右）。

当体系中存在多种化学环境不同的原子核时，为了能用一个脉冲同时激发所有这些原子核，脉冲的持续时间 Δt 必须足够短（通常约 10μs），相应的 B₁ 强度则要足够大。这种脉冲被称为“硬脉冲”，其频率范围能覆盖所有目标核的化学位移。相反，持续时间长、强度弱的脉冲则称为“软脉冲”，它只能选择性地激发特定频率的原子核。

通用的一维NMR实验流程可概括为三个阶段：准备期（通过脉冲扰动自旋体系，使其脱离平衡态）、演化期（让体系在扰动后自由演化一段时间）和检测期（采集FID信号，探测演化期发生的变化）。

自旋去偶

自旋去偶是一种强大的谱图简化与指认技术。假设原子核A和X通过J-耦合相互作用，导致彼此的信号都产生裂分。如果在检测A信号的同时，用一个强微波脉冲选择性地持续照射X核，X核的自旋态会发生极快地翻转。对于A核而言，它感受到的将是X核自旋态的平均效果，这使得J-耦合效应被消除，A的信号从裂分峰恢复为单峰。通过系统地对谱图中成对的裂分峰进行去偶实验，我们能够确认分子网络中相距3-4个化学键的J-耦合关系。

选择性极化反转（SPI）

SPI是另一种揭示耦合关系的精妙方法，尤其适用于异核体系，例如 ¹³C（A核）和 ¹H（X核）。在热平衡状态下，由于二者磁旋比 γ 的巨大差异，其能级布居数差别悬殊，表现为NMR信号强度的不同（图6a）。

图6. (a, b) 异核选择性极化反转（SPI）。(a) 热平衡状态；(b) 当¹H被选择性激发后。

如果我们用一个软脉冲选择性地激发¹H的某个跃迁，使其能级布居发生反转（图6b），¹³C的信号强度会发生剧烈变化，甚至出现相位相反的负信号。这种信号强度的变化直接证明了A核与X核之间存在耦合。与NOE效应不同，J-耦合导致的极化转移是瞬时发生的，这为我们区分J-耦合和偶极-偶极耦合提供了依据。此外，这类极化转移技术还能显著增强¹³C等低灵敏度原子核的信号。

二维核磁共振（2D-NMR）：从线性谱到关联图

对于小分子，一维NMR技术或许足以完成信号指认。但面对蛋白质这样谱线极度拥挤的大分子，必须借助更高级的手段。二维核磁共振（2D-NMR）应运而生，它将拥挤的信号在一个二维平面上展开，根据原子核之间的相互作用类型（如J-耦合或NOE）建立关联。

图7. 2D-NMR的脉冲序列示例。(a) 异核2D-NMR；(b) 同核2D-NMR (COSY)。

以一个异核（¹³C-¹H）J-耦合体系为例（图7a），其脉冲序列与矢量模型演化如图8所示。在检测¹³C的FID信号之前，先对¹H施加两个由时间 t₁ 隔开的90度脉冲。第一个脉冲将¹H磁化矢量翻转至y’轴。在接下来的演化期 t₁ 内，该矢量以 Ω_H = δ_H ± J_CH/2 的频率在旋转坐标系中进动。第二个90度脉冲将这个演化后的矢量再次翻转。此时，¹H磁化矢量在z轴上的投影分量大小为 Mcos(Ω_Ht₁)，这个分量的大小会通过J-耦合调制¹³C的能级布居，进而影响我们最终检测到的¹³C信号强度。

图8. 异核2D-NMR的矢量模型图解。

通过系统地改变演化时间 t₁，并记录每次对应的¹³C信号强度，我们得到一个以 t₁ 为变量的信号振荡。对这个振荡信号进行第二次傅里叶变换（对 t₁ 维度），就能得到¹H的频率信息。最终，我们获得一张二维谱图（图9），一个频率轴是¹³C的化学位移（ν₂），另一个是¹H的化学位移（ν₁）。谱图上的“交叉峰”（off-diagonal peaks）清晰地表明了哪些¹³C和¹H原子核之间存在J-耦合。这种方法极大地简化了复杂谱图的解析。

图9. ¹³C与¹H J-耦合体系的示意性2D-NMR谱图。

COSY 与 NOESY

COSY（相关谱）是上述方法的同核版本，广泛用于寻找¹H-¹H之间的J-耦合关系（图7b）。其交叉峰表明两个质子通过化学键相连（通常在3-4个键之内）。图10展示了图3中多肽的COSY谱图，其交叉峰网络清晰地揭示了氨基酸残基内部的自旋系统。

图10. 环状-GRGDSPA多肽的DQF-COSY谱图。

NOESY（核欧豪瑟效应谱）则是在演化期和检测期之间增加了一个“混合期”（mixing time, t_m）（图11）。在混合期内，由于NOE效应（偶极-偶极相互作用），空间上邻近（通常< 5Å）的原子核之间会发生磁化交换。其二维谱图（见图12矢量模型）上的交叉峰直接反映了原子核在空间上的接近程度，这对于确定大分子的三维构象至关重要。

图11. NOESY实验的脉冲序列。

实验样品要求与挑战

获取高质量的NMR数据对样品有一定要求。由于NMR信号强度与自旋数量成正比，通常需要毫克级别或浓度在1mM以上的样品才能获得足够的信噪比。

此外，谱图的质量也受多种因素影响。自旋量子数 I > 1/2 的原子核因强烈的四极矩相互作用，谱线通常很宽，不适合高分辨率研究。即便对于 I = 1/2 的核，磁场不均匀性也会导致FID信号快速衰减和谱线展宽。虽然自旋回波等技术可以部分克服磁场不均匀性，但由分子各向异性屏蔽导致的谱线展宽仍然是棘手问题。对于在溶液中快速运动的小分子，这种各向异性会被平均掉，得到尖锐的谱峰（运动窄化效应）。然而，对于运动缓慢的大分子，该效应不明显，导致谱图分辨率下降。

因此，对缺乏运动性的大分子进行NMR分析极具挑战性。尽管发展了多种技术来应对，但目前通过NMR进行结构解析的分子量上限大约在 3 × 10⁴ Da 左右。这与X射线衍射技术形成了鲜明对比，后者原则上可以解析像核糖体（分子量 4 × 10⁶ Da）这样巨大的分子复合物，前提是能获得高质量的单晶。要获得一张信噪比高、结果可靠的图谱，对样品制备、设备参数配置都有极高要求。这正是专业检测实验室的核心价值所在。

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