液相色谱（LC）技术原理与定量分析方法深度解析

液相色谱（LC）是一种在溶液环境中分离并检测有机与无机化合物的核心分析技术。其应用范围极广，几乎不受限制地覆盖了极性、非极性、芳香族、脂肪族及离子型化合物。一套典型的液相色谱系统由溶剂输送单元（泵）、样品导入装置（手动进样器或自动进样器）、色谱柱和检测器构成。该技术的灵活性主要源于两大方面：一是针对特定分离难题而设计的各类专用色谱柱，二是具备高灵敏度与高选择性响应的多种检测器。任何液相色谱方法构建的终极目标，都是在色谱分离或检测环节，将目标化合物与干扰物有效分离开，从而获得与分析物浓度成正比的仪器响应信号。

技术原理剖析

液相色谱中的保留行为，本质上是溶质分子在两个不相溶的物相中不同缔合作用的结果。在最简化的模型中，所有色谱系统都包含一个固定的“固定相”和一个流动的“流动相”。溶质分子在两相间的扩散过程，其时间尺度远快于流动相的宏观流速。正是由于不同溶质分子与固定相发生差异化的相互作用，导致它们在色谱柱中的迁移速度被不同程度地延缓，最终实现分离。

保留过程是溶质分子、固定相配体以及流动相分子之间一系列复杂相互作用的综合体现。色谱柱自身的特性，例如基质的物理化学性质、用于制备固定相的表面改性工艺、极性等，都对保留行为产生决定性影响。

根据固定相和流动相极性的相对关系，可将液相色谱分为两种操作模式：

• 正相液相色谱 (Normal-Phase LC, NP-LC)：流动相的极性低于固定相。
• 反相液相色谱 (Reversed-Phase LC, RPLC)：流动相的极性高于固定相。

在开发一个LC方法时，色谱柱的选择至关重要。目前，绝大多数分离分析工作都在反相模式下进行，其中十八烷基硅烷（Octadecylsilane, ODS）键合相色谱柱，即我们常说的C₁₈柱，应用最为普遍。仪器的响应信号通常通过光谱学检测器获得，当然也存在其他类型的检测技术。常见的检测器包括紫外/可见光吸收（UV/vis）、荧光（FL）、电化学（EC）、示差折光（RI）、蒸发光散射（ELSD）以及质谱（MS）检测器。

应用范围与样品考量

液相色谱适用于所有能溶于（或通过衍生化反应变得可溶于）合适溶剂，并能从色谱柱上被洗脱下来的化合物。要实现准确定量，前提是将目标组分与各类干扰物彻底分离。尽管有时液相色谱被视为一种中低分辨率技术，单次分析通常只能分离约50至100种化合物，但通过联用高选择性检测器，系统的整体分离能力可以得到极大提升。近年来，将质谱作为LC的选择性检测器已成为主流趋势。总体而言，液相色谱技术尤其适合那些热不稳定或不具挥发性，因而无法采用气相色谱等气相分离技术的溶质。

对于样品本身，液相色谱的应用对象非常广泛，但所有样品都必须经过提取或溶解，以溶液形式注入液相色谱仪。为了降低样品基质的复杂性，常常需要对样品进行富集（或称“净化”），常用方法包括液-液萃取、固相萃取（SPE）或液相色谱组分分离。处理后的样品提取液应与流动相有良好的互溶性，并且通常采用较小的进样体积（1 μL 至 20 μL）。当样品提取液与流动相组分不兼容时，则需要进行溶剂置换。

定性与可溯源的定量分析

在定性分析中，液相色谱有时用于通过比对样品组分的保留时间与真实标准品的保留时间，来对样品成分进行初步鉴定。这种鉴定结果必须由其他互补性技术加以验证。不过，如果保留时间不一致，通常足以证明样品中不含所怀疑的化合物。

在定量层面，液相色谱是一种相对测量技术，其准确性高度依赖于校准过程。其校准与定量流程，与气相色谱、质谱、毛细管电泳等其他有机分析仪器技术颇为相似。有机化合物的定量测定，通常基于未知样品与校准品（Calibrants）仪器响应值的比较。校准品是使用已知高纯度的标准物质，通常以质量分数基准来精确配制的。这种比较通过多种数学模型完成，尽管响应值与分析物浓度之间的线性关系模型最为常用，但这并非定量的硬性要求，非线性模型同样可以被有效运用。

实践中，主要有三种定量策略可供选择：外标法、内标法和标准加入法。

1. 外标法 (External Standard Approach)

外标法直接比较未知样品中分析物的绝对响应值与一系列校准品的绝对响应值。这种方法通常在无法找到合适的内标物，或样品与标准品的质量能够被精确控制时使用。外标法对操作要求极为苛刻，因为样品处理或进样过程中的任何损失都会直接影响最终结果的准确性。所有涉及的体积（或质量）必须精确计量，样品转移过程必须是定量的。

2. 内标法 (Internal Standard Approach)

内标法是在所有校准品和未知样品中，加入一种（或多种）待测样品中不存在的组分作为内标物。最终计算依据的是分析物相对于内标物的相对响应值。内标法的使用，极大地降低了对定量转移的苛刻要求，并能有效校正样品处理过程中的损失所引入的偏差。理想情况下，内标物应与目标分析物具有相似的化学物理性质。即便性质不尽相同，一个不相关的内标物有时也能作为“体积校正器”发挥作用。

在同位素稀释法中，通常选用目标分析物的同位素标记物作为内标。对于质谱检测，通常要求同位素标记物与分析物有至少2个质量单位的差异，且取代发生在非活泼原子上。对于非质量选择性检测器（如UV检测器），需要色谱上能分离同位素标记物，这在氘代原子数达到8-10个或更多时有时是可能实现的。当检测器不具选择性时，内标物必须与分析物在色谱上完全分离。反之，对于质谱这类高选择性检测器，则不要求分离，甚至常常希望内标物与分析物共流出，以提高测定精度（如同位素稀释法）。

3. 标准加入法 (Standard Addition Approach)

标准加入法是在未知样品中加入一个或多个已知量的校准品。对每一个未知样品，至少需要制备两个浓度水平的样品（其中一个可以是未添加校准品的原样）。由于需要为每个未知样品单独进行校准，这种方法工作量巨大，但对于处理复杂基质效应非常有效。

获取一份准确可靠的定量分析报告，需要对上述方法有深刻理解，并根据样品特性、分析目标和实验室条件做出正确选择。这正是专业检测实验室的核心价值所在。

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校准曲线构建与内标选择策略

无论是外标法还是内标法，都可以采用平均响应因子、过零点线性回归、计算截距线性回归或其他非线性模型进行拟合。响应值可以进行加权或不加权处理，所选模型必须经过评估，以确认其适用于当前的测量问题。

校准品的数量和浓度水平取决于具体的测量任务。如果能够预估未知样品的浓度范围，那么校准品的浓度就应围绕这个范围来配制，这样做可以最大程度地规避响应线性问题。如果对未知样品浓度一无所知，或者样品浓度跨度很大，那么校准品就应覆盖整个可能的浓度范围。任何情况下，都应极力避免对校准曲线范围之外的浓度进行外推。在条件允许时，应通过独立的称量过程来制备校准品，避免使用系列稀释或依赖单一储备液，以减少误差累积。

当方法中包含内标物时，其添加水平应与待测组分的水平相近。内标物在校准品和未知样品中的响应值应保持一致或相似，同时内标物与分析物的响应比也应在一个合适的范围内。在可能的情况下，分析物和内标物的绝对响应值都应显著高于噪音水平。如果未知样品中分析物的浓度非常低，内标物的添加量则应相对较高，因为一个信噪比高的内标信号有助于提升整体的测量精密度。