定量核磁氢谱（¹H qNMR）：原理、实践与精准分析指南

在化学分析领域，核磁共振（NMR）波谱法因其在分子结构鉴定方面的强大能力而广为人知。然而，它的应用远不止于此。当实验条件得到严格控制时，NMR能够从一种定性工具转变为一种高精度的定量技术，即定量核磁共振（qNMR）。特别是氢谱（¹H qNMR），凭借其高灵敏度和高天然丰度，已成为药物研发、材料科学和质量控制中进行纯度测定与含量分析的基石方法。

¹H qNMR 技术的核心原理

要理解qNMR，我们首先需要回到核磁共振现象的物理本质。

当一个原子核的自旋量子数(I)不为零时，它就像一个微小的磁体。当被置于一个均匀的强外磁场（B₀）中，这些核磁偶极子会沿着外磁场进行特定的取向。取向的数量由自旋量子数决定，为 (2I + 1) 种。对于 ¹H（质子），I = 1/2，因此存在两种自旋状态（高能态和低能态），且在低能态的原子核数量会略多一些。

通过施加特定频率的射频辐射（RF），可以诱导原子核从低能态跃迁至高能态。这个特定的频率被称为拉莫尔频率或共振频率。在共振时，原子核吸收射频能量，这一吸收过程可以被检测和测量。现代核磁谱仪多采用射频脉冲（RF pulse）的方式，它能在瞬间激发样品中所有相关的原子核。

共振发生时，除了能量跃迁，各个核磁偶极子的自旋相位也会同步，从而产生一个可被检测的宏观净磁化矢量。当射频脉冲结束后，核自旋系统会通过一级速率过程恢复到其热力学平衡态。这个恢复过程主要包含两个独立的弛豫机制：

• 自旋-晶格弛豫 (Spin-Lattice Relaxation)：指自旋系统将吸收的能量传递给周围环境（晶格），使自旋布居数恢复到平衡态的过程，其速率常数为 1/T₁。
• 自旋-自旋弛豫 (Spin-Spin Relaxation)：指同步的自旋相位因相互作用而被打乱（失相）的过程，其速率常数为 1/T₂。

脉冲结束后采集到的信号被称为自由感应衰减（FID），这是一个在时域（强度 vs. 时间）上的复杂信号。通过傅里叶变换（FT），这个时域信号可以被转换成我们熟悉的频域谱图（强度 vs. 频率）。为了提高信噪比（S/N），通常会进行多次FID采集并进行时间平均。信噪比的改善程度与采集次数的平方根成正比，前提是两次脉冲之间有足够的时间让所有原子核完全弛豫。

从结构信息到定量基础

分子中不同化学环境的同种原子核，其周围的电子云屏蔽效应不同，导致它们的共振频率会产生微小的差异，这就是化学位移。它为我们判断原子在分子中的结构环境提供了基础。

邻近原子核的磁场也会对目标核产生影响，导致其能级进一步分裂，形成耦合裂分。这些裂分模式揭示了邻近原子核的类型和数量信息。

尽管不同种类原子核的共振频率差异巨大（MHz级别），但同种原子核的化学位移范围较小（kHz级别），而耦合裂分带来的差异则更小（Hz级别）。正是这些精细的差异，构成了NMR定性分析的基石。

从定性到定量：qNMR的分析应用

定性分析能力

通过解析化学位移、耦合裂分模式和积分面积，NMR可以：

• 确定分子的原子连接方式。
• 区分结构异构体。
• 分析混合物组分和分子构象。
• 通过与手性试剂作用，甚至可以区分对映异构体。
• 监测化学反应的进程和程度。
• 研究分子内构型、构象或互变异构的转化速率。

可溯源的定量分析

qNMR的核心价值在于，在严格的实验条件下，NMR谱峰下的积分面积（信号强度）与产生该信号的原子核数量成正比。并且，对于同一张谱图中的所有信号，这个比例常数是相同的。这一特性使得NMR成为一种出色的一级测量方法，无需使用待测物的标准品进行校准。

1. 相对浓度测定

通过比较样品中不同物质的谱峰积分面积，可以直接得到它们的摩尔比。

$$ /frac{C_t}{C_n} = /frac{(I_t / N_t)}{(I_n / N_n)} /tag{1} $$

其中：

• C_t, C_n: 分别为待测物和其他物质的浓度
• I_t, I_n: 分别为待测物和其他物质的信号积分面积
• N_t, N_n: 分别为产生该信号的等价原子核数目

2. 摩尔纯度测定（无内标法）

如果谱图中的所有信号峰都能被识别并归属于特定的分子，我们就可以在不添加任何标准品的情况下，直接计算待测物的摩尔纯度。当然，前提是所有杂质都能在谱图上被观测到。

$$ /text{mole%} P_t = /frac{(I_t / N_t)}{/sum (I_n / N_n)} /times 100 /tag{2} $$

其中：

• P_t: 待测物的纯度
• I_t, N_t: 待测物的信号积分和对应的核数
• I_n, N_n: 其他所有信号的积分和对应的核数

3. 质量纯度测定（内标法）

在更普遍的应用中，我们通常采用内标法来测定样品的绝对纯度。该方法是在一个精确称量的待测样品溶液中，加入一个精确称量的、纯度已知的内标物。这是目前应用最广泛、结果最可靠的qNMR方法。

$$ /text{mass%} P_t = /frac{I_t}{I_s} /frac{N_s}{N_t} /frac{M_t}{M_s} /frac{W_s}{W_t} P_s /times 100 /tag{3} $$

其中：

• P: 纯度
• I: 信号积分面积
• N: 产生信号的等价核数目
• M: 摩尔质量
• W: 称量的质量
• 下标 t 和 s 分别代表待测物 (test material) 和内标物 (standard)

这个公式的逻辑非常清晰：通过引入一把精确的“分子尺”（内标物），来精确度量未知样品的含量，并将摩尔比关系最终转换为实际工作中更常用的质量百分比。

获得精准qNMR数据的关键条件

qNMR的准确性高度依赖于严谨的实验操作。任何一个环节的疏忽都可能导致结果的巨大偏差。

• 谱图质量：必须优化信噪比和分辨率。高分辨率能确保谱峰分离良好，便于准确积分。
• 充分弛豫：为避免弛豫效应对积分准确性的影响，脉冲重复延迟时间（pulse delay）应足够长（通常建议大于最长T₁的5倍），以确保所有原子核在下次脉冲前都能完全弛豫。
• 均匀激发：射频脉冲的激发范围应能均匀覆盖整个谱宽，避免谱图两端的信号强度失真。
• 积分一致性：对于因 ¹³C 偶合产生的卫星峰，必须采取一致的处理方式——要么始终包含在主峰积分内，要么始终排除。高场谱仪有助于将卫星峰与主峰更好地分离。
• 样品制备的洁净度：这是最容易被忽视，却也至关重要的环节。
  • 溶剂：应使用高纯度氘代溶剂，以避免杂质干扰。
  • 核磁管：必须彻底清洗，并用NMR溶剂润洗后，在140°C下过夜烘干。
  • 操作工具：移液管、药勺等必须绝对洁净。裸手接触移液管针头可能引入皮肤油脂（如角鲨烯），造成污染。
  • 样品管帽：严禁样品溶液接触管帽或隔垫，否则会萃取出增塑剂等污染物，使样品报废。
• 称量准确性：在使用内标法时，称量误差往往是整个不确定度的主要来源。需注意消除核磁管上的静电荷对称量造成的干扰。
• 内标物选择：理想的内标物应纯度高且已知、化学性质稳定、信号峰少且处于谱图的空白区。内标物的纯度及其不确定度是决定最终结果准确性的关键参数。

要获得一张信噪比高、结果可靠的图谱，对样品制备、设备参数配置都有极高要求。这正是专业检测实验室的核心价值所在。 精工博研测试技术（河南）有限公司（原郑州三磨所国家磨料磨具质量检验检测中心），央企，国字头检测机构，专业的权威第三方检测机构，专业检测化合物纯度与含量检测，可靠准确。欢迎沟通交流，电话19939716636

qNMR 的应用范围与性能

现代NMR谱仪能够常规地将 ¹H qNMR 的检测和定量水平推进到 0.01% 质量分数级别，不确定度（U₉₅）可控制在 0.5% 至 1.0% 的范围内。通过增加数据采集时间，检测限和定量限还能进一步降低一个数量级。配备了低温探头和前置放大器的高场谱仪，则能将此极限再拓展四倍。

尽管qNMR的极限灵敏度不及质谱或荧光光谱等技术，但其在中等痕量水平测定中的应用正日益增多。此外，NMR与色谱分离技术的联用（LC-NMR），进一步拓宽了其在复杂体系分析中的应用前景，使其成为现代分析科学中不可或缺的强大工具。

常见NMR活性核的性质

虽然有多种NMR活性核，但日常应用主要集中在少数几种，幸运的是，有机分子的主要构成元素的同位素都在此列。¹H 因其极高的天然丰度和灵敏度，成为最常用的观测核。

表1. 常见NMR活性核的性质