监测生物降解的分析方法

用于跟踪降解过程的分析工具取决于研究目的和所使用的测试环境。以下介绍几种常用的分析方法。

视觉观察 对塑料的可见变化进行观察是许多测试都可以实施的。用于描述降解的效果包括：表面生物膜的形成、材料颜色的变化、表面粗糙化、孔洞或裂纹的形成，或碎裂的发生。如前所述，这些变化并不能证明聚合物质量转化为生物质和自然代谢产物的生物降解过程，但视觉变化参数可作为微生物侵蚀的初步迹象。通过扫描电子显微镜（SEM）或原子力显微镜（AFM）技术可以获得更详细的降解过程信息。图3展示了一个例子，显示了聚(β-羟基丁酸酯)（PHB）薄膜在厌氧环境中孵育前后的SEM显微照片。在降解过程中，结晶球粒出现在表面。这是由于非晶态聚合物部分被优先降解，从而将降解速度较慢的结晶部分“蚀刻”出来。

特别是AFM技术的最新发展，使得对聚合物降解机理进行非常详细的研究成为可能。

聚合物链长和力学性能的变化 与视觉观察类似，材料性能的变化本身也不能作为评估聚合物降解的最终依据，因为这些测量并不直接证明塑料材料的新陈代谢。然而，当降解过程对材料的影响很小时，通常会使用力学性能的变化来监测。拉伸强度等性能对聚合物摩尔质量的变化非常敏感，而摩尔质量本身也常被直接用作降解的指标。对于发生在表面的酶促攻击，只有在观察到显著的质量损失时（样品因表面侵蚀过程而变薄；材料内部未受影响），材料性能才会改变。而对于非生物降解过程，情况通常相反。它们通常贯穿整个材料（例如，聚酯的水解或聚乙烯的氧化），在观察到因降解中间体溶解而导致的质量损失之前，塑料的力学性能就已经发生了显著变化。

因此，这类测量常用于那些由非生物过程主导第一步降解的材料，例如聚乳酸的化学水解或改性聚乙烯的氧化。

重量损失测量/残留聚合物的测定 测量测试样品（薄膜、测试棒或整个物品）的质量损失是常用的方法，尤其是在现场和模拟测试中。然而，同样地，这些数据也无法直接证明生物降解的发生。在正确清洁样品或当材料严重崩解时，可能会出现问题。在后一种情况下，可以将样品放置在小网袋中以便回收，这种方法在ISO 16929的全面堆肥程序中有所应用。对塑料样品周围基质进行筛分分析，可以更好、更可重复地定量测定崩解过程。

通过适当的分离或提取技术（将聚合物与生物质分离，或从土壤、堆肥中提取聚合物），可以测定精细分散的聚合物样品（如粉末）的降解情况。这一程序必须针对每个具体系统进行仔细调整和验证。结合对残留材料和低分子量中间体的结构分析，可以深入了解降解过程。

CO₂产生量和O₂消耗量的测定 在好氧条件下，微生物利用氧气氧化碳，并形成二氧化碳作为主要的代谢终产物之一。测定耗氧量（呼吸计量测试）或二氧化碳生成量（所谓的“Sturm测试”）是聚合物降解的良好指标，也是实验室测试中最常用的监测生物降解过程的方法。在使用合成矿物培养基的实验室测试中，聚合物是系统中主要的碳源，只需面对较低的背景呼吸。因此，测试的准确性通常很好。这类测试已被用于评估低分子量化学品在水中的可降解性（例如，在OECD指南中），现在已被修改用于生物降解塑料，以考虑通常疏水、不溶于水的材料的特殊特性。同时，更先进的CO₂测定实验方法也被引入标准。除了传统的将CO₂捕获在Ba(OH)₂溶液中并结合手动滴定的方法外，使用红外检测器和顺磁性O₂检测器检测曝气气流中的O₂和CO₂浓度也常用于此类实验。

然而，除了自动化和连续测量的优点外，这类测量也存在一些缺点。必须精确知晓空气流量，且检测器的信号必须在数周甚至数月内保持稳定。如果需要监测缓慢的降解过程，CO₂浓度或O₂浓度的下降非常小，增加了在如此长时间的实验中出现系统误差的可能性。在这里，将CO₂捕获在碱性溶液（约pH 11.5）中并进行连续滴定，或检测溶解的无机碳，是有效的替代方法。其他解决CO₂检测问题的尝试使用了非连续曝气的封闭系统。文献中报道了结合红外气体分析仪的气体采样技术或滴定系统。Solaro等人描述了另一种采用非连续滴定方法的封闭系统。使用小型密闭瓶作为降解反应器，并通过分析顶部空间中的CO₂或溶解氧的减少（所谓的“密闭瓶测试”）来进行的测试，简单且对泄漏等问题不敏感，但可能因只能使用少量材料和接种物而引发问题。

通过CO₂测定来监测聚合物降解的方法也被应用于固体基质（如堆肥）中的测试。这类方法现在已作为“受控堆肥测试”（ASTM D 5338-98e1, ISO 14855, JIS K 6953）被标准化。实际上，“受控堆肥测试”并不模拟一个真实的堆肥过程，因为在该测试中使用的是成熟堆肥而非新鲜生物废物作为基质。生物废物含有大量易于降解的碳，会产生过高的背景CO₂，不利于精确测量。因此，使用已经转化的生物废物（即成熟堆肥）代替新鲜生物材料。

通过二氧化碳检测来监测土壤中的聚合物降解比在堆肥中更为复杂。通常显著较慢的降解速率导致一方面测试周期非常长（可达两年），另一方面与土壤中背景CO₂的形成相比，CO₂的释放量相当低。Solaro等人发表了该领域的最新测试进展。尽管存在上述问题，但用于测试塑料在土壤中降解的标准化方法目前正在制定中（ISO/PRF 17556）。

为了避免来自堆肥或土壤等天然基质的高背景CO₂形成问题，已使用惰性、无碳的多孔基质代替土壤或堆肥。然后用合成培养基润湿惰性基质，并接种混合微生物群。这种方法在模拟堆肥条件（约60°C下的降解）时证明是可行的，但至今未能为土壤条件进行充分优化。

沼气测量 类似于好氧生物在有氧条件下形成CO₂，厌氧微生物主要产生二氧化碳和甲烷的混合物（称为“沼气”）作为其代谢反应的主要终产物。沼气的量和组成可以通过所谓的Buswell方程从材料组成中理论计算得出。沼气产量主要用于监测厌氧条件下塑料的生物降解，处理塑料厌氧生物降解的标准也基于此类测量（ISO/DIS 15985, ASTM D 5210, ASTM D 5511）。沼气体积可以很容易地通过压力计法或简单的水置换法测定。此外，还可以分析沼气的组成，例如，通过采集产生的气体并用气相色谱法进行分析。

与二氧化碳释放的讨论一样，基本问题是来自接种物的沼气形成。特别是对于缓慢的降解过程，这个问题会影响测试方法的准确性。Abou-Zeid通过用合成矿物培养基稀释厌氧污泥，尝试减少背景沼气的产生。

¹⁴C标记 使用¹⁴C放射性标记的生物降解聚合物可以避免上述许多问题。即使同时有来自其他碳源（如生物废物）的二氧化碳产生，极低浓度的¹⁴CO₂也能被检测到。因此，放射性标记尤其适用于在含有除塑料外其他碳源的基质中研究缓慢降解的材料。然而，在许多情况下，生产¹⁴C标记的材料存在问题，并且从实验角度来看，进行放射性物质的工作也存在挑战。

透明圈形成 所谓的“透明圈测试”是一种非常简单的半定量方法。在该测试中，聚合物以非常细小的颗粒形式分散在合成培养基琼脂中，导致该琼脂外观不透明。当接种能够降解该聚合物的微生物时，菌落周围形成一个清晰的晕圈（见图4），表明这些微生物至少能够解聚该聚合物，这是生物降解的第一步。该测试常用于筛选能够降解特定聚合物的微生物，也可以通过分析透明圈直径的增长来获得半定量结果。

其他方法 文献中还描述了一些其他用于监测生物降解过程的分析方法，特别是在使用解聚酶的降解实验中：

• 分析塑料周围培养基中溶解有机碳（DOC）的量。
• 监测分散在水中的小聚合物颗粒光密度的降低。
• 使用光散射法分析小聚合物颗粒尺寸的减小。
• 应用pH-stat滴定法测定酶促聚酯裂解中形成的游离酸。

生物降解塑料的标准体系

九十年代初，工业界率先提出了建立合适且可靠的标准化测试程序来评估塑料生物降解性的要求。大多数新制定的标准都基于现有的低分子量化学品生物降解测试。表3概述了生物降解塑料的标准测试方法。

ASTM率先发布了主要关注水和垃圾填埋环境的标准。德国DIN则首先开发了评估塑料可堆肥性的测试体系（DIN V 54900）。该标准不仅规定了测试程序，还定义了评估的限值。ISO、CEN和ASTM等其他国际标准大体上遵循了DIN V 54900给出的测试策略，该标准现已被相应的欧洲标准（EN 13432）取代。

目前，标准制定的重点集中在土壤中的降解，因为生物降解塑料在农业领域的应用，如不可回收的地膜或作为养分或农药控释基质等，引起了极大的兴趣。与堆肥环境中的降解相比，评估土壤环境下降解的测试被证明要复杂得多（例如，由于不同的土壤类型或外部条件的巨大差异）。

以下是参与制定生物降解塑料标准的标准化机构列表：

• 国际: ISO TC61/C5/WG22 “Biodegradability”
• 欧洲:
  • CEN TC 261/SC4/WG2 “Biodegradability and organic recovery of packaging and packaging waste”
  • CEN TC249/WG9 “Characterization of degradability”
• 国家:
  • 法国: AFNOR
  • 德国: DIN FNK 103.3 “Bioabbaubare Kunststoffe” (该工作组已于2002年解散)
  • 意大利: UNI
  • 日本: MITI/JIS
  • 美国: ASTM D20.96 “Environmentally degradable plastics”

接下来将更详细地讨论某些特定环境下生物降解塑料的标准。

塑料的可堆肥性

将生物降解塑料在堆肥过程中处理，被视为塑料回收或焚烧之外的一种替代方案。已发布的一系列评估塑料可堆肥性的标准，在主要方面都相当一致（ASTM D 6002-96/ASTM D 6400 99e1, EN 13432 2000）；一项国际标准（ISO CD 15986）目前正在制定中。通常，对可堆肥性的要求超过了对生物降解性的要求；可堆肥性通常包含四项要求：

1. 材料的有机组分必须能够完全生物降解。
2. 材料必须在堆肥过程中充分崩解。
3. 添加塑料不应对堆肥过程产生负面影响。
4. 堆肥质量不应受到负面影响，且不应出现毒性效应。

考虑到这一系列标准以及在复杂（自然）环境中测试生物降解性的根本问题，所有的测试方案都遵循一个逐次、多步骤的评估策略：

1. 测试材料的化学表征 这些数据用于识别材料，为后续测试提供重要数据（如碳含量、成分、无机组分含量等），特别是提供有关重金属等有毒物质的信息。

2. 生物降解性评估 生物降解性通过监测材料代谢过程中CO₂的形成或O₂的消耗的实验室测试方法进行评估。两种测试方法使用合成水性介质（ISO 14851, ISO 14852），并允许建立碳平衡（除了二氧化碳，新生成的生物质也被视为“已降解”的碳）。然而，首选的测试方法是所谓的受控堆肥测试，该测试在约60°C的温度下，使用成熟堆肥作为基质。在针对堆肥环境的测试方案中，水性测试的相关性受到了批判性讨论。然而，受控堆肥测试的缺点是背景CO₂形成率相对较高，这可能受到塑料存在的“启动效应”的影响，并且难以足够精确地确定碳平衡。为了克服这些问题，生物降解率是相对于可降解参考物质（如纤维素）的CO₂释放量来计算的，或者使用接种了堆肥浸出液的惰性固体基质代替成熟堆肥。

   在测试方案中，也给出了评估的限值。最长测试持续时间通常为6个月（在ASTM D6400中，对于放射性标记材料为1年），要求的降解率是相对于参照物的60%和90%。60%的CO₂形成值源于为低分子量、化学均一材料制定的OECD指南。该数值考虑了部分碳转化为生物质。然而，塑料的成分复杂（共混物、共聚物、助剂），因此设定了90%的限值，以确保整个材料的完全降解（假设降解测试有10%的误差范围）。在水性介质中，这个限值通常只有在包括了形成的生物质（碳平衡）的情况下才能达到。在成熟堆肥中，新形成的生物质较少，许多聚合物观察到的CO₂水平超过90%。

3. 堆肥中崩解性的表征 由于在真实的生物废物中无法足够精确地进行呼吸计量测量，因此在真实的堆肥环境中只评估材料的崩解情况。崩解测试可以在使用数百升容量的受控反应器的实验室测试中进行，或在真实的堆肥厂中进行测试。崩解程度通过筛分堆肥并分析大于2mm的聚合物碎片来确定（在所有标准中，允许的最大比例为10%）。

4. 堆肥质量/毒性 当塑料被堆肥时，最终堆肥的质量不应受到负面影响。评估这一要求的测试由已建立的国家测试方法定义，以确保堆肥质量。堆肥质量的标准包括，例如，成熟度、视觉杂质、密度、pH、养分、盐和重金属等的含量。此外，关注植物生长的生态毒性测试是堆肥质量表征的一部分（例如，根据OECD指南208的植物测试）。在标准制定过程中，曾讨论过其他毒性测试（例如，蚯蚓、发光细菌、水蚤、鱼类测试），但由于这些测试与堆肥结合的经验有限，这些测试未被普遍纳入可堆肥性测试方案（ASTM包括根据OECD指南207的蚯蚓测试）。

厌氧生物降解性

除了“常规”堆肥，通过厌氧消化（“厌氧堆肥”）处理生物废物也变得越来越普遍。研究表明，塑料在厌氧条件下的生物降解行为可能与好氧条件下显著不同。因此，必须建立独立的测试来涵盖这些塑料生物降解的条件。一些通过沼气形成监测厌氧降解的标准方法已经存在（ASTM D 5511-94, ISO/DIS 14853 1999, ISO/DIS 15985 1999），这些方法基于为低分子量物质设计的测试协议。然而，迄今为止，生物降解塑料的评估方案并未强制要求证明厌氧降解性（在EN 13432中提到了厌氧测试，但为可选项目）。

土壤环境中的生物降解

在标准化工作的初期阶段，重点先是垃圾填埋场的降解，然后是堆肥过程。而当前，评估塑料在土壤中生物降解的表征变得重要，因为现在人们对生物降解塑料在农业中的应用（例如，作为地膜或作为化肥和农药的控释基质）越来越感兴趣。

与评估可堆肥性相比，专注于土壤降解的测试方法的标准化面临一些严峻问题：

• 堆肥是一个技术过程，其中pH、温度、湿度和生物废物成分等参数被控制在一定范围内，以保证最佳的堆肥过程。而在土壤中，环境类型和环境条件可能变化显著，并且在自然界中通常无法控制。标准必须以某种方式考虑到这些变化。
• 较高的温度和微生物活性，导致塑料在堆肥过程中的生物降解通常比在自然土壤环境中快。
• 以足够的准确性监测某些塑料在土壤中缓慢的降解过程要困难得多。缓慢的降解有时会导致极长的测试周期（超过1年）。

目前，CEN工作组CEN TC249/WG9“可降解性表征”正在为塑料的土壤降解制定一个评估方案。该方案的结构很可能与堆肥的方案大体相似，包括上述的不同方面。然而，由于条件的可变性和应用的不同，该测试方案将比可堆肥性标准更为复杂。

描述在土壤中测试塑料生物降解实验条件的首批标准已经建立（ISO/PBF 17556-2002）。Solaro等人提出了一个在封闭系统中，使用最少量土壤检测CO₂的方法；Albertsson等人发表了一项基于¹⁴C标记样品的研究。除了可能的低二氧化碳释放率外，在土壤中确定碳平衡也存在问题，并且观察到添加的聚合物对背景CO₂释放的影响（“启动效应”）。正如对受控堆肥测试提出的那样，也在研究使用惰性基质如蛭石。

土壤中崩解行为的评估也存在问题。土壤特性和环境条件对塑料降解的影响已在一些出版物中进行了研究。为了解决这个问题，正在讨论在一整套选定的不同土壤中进行降解测试，或者使用混合土壤进行测试。应对这些复杂的测试要求和标准解读，往往需要专业的知识和经验。

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