荧光与磷光光谱技术：原理、应用与定量校准方法

荧光与磷光光谱技术，其核心是研究化学物质在吸收光能后，所发射出的紫外、可见及近红外（NIR）区域的光。这一过程的起点是光吸收，它使物质从基态跃迁至电子激发态。随后，物质通过发射光子的方式回到基态，所发射的光波长通常长于激发光波长，即能量更低。专门用于测量这种发射光强度随波长变化的仪器，我们称之为荧光光谱仪或荧光计。

光致发光主要包含两种类型：荧光（Fluorescence）和磷光（Phosphorescence）。两者在发光机理和寿命上存在本质区别：

• 荧光：寿命极短，通常在1至10纳秒（ns）之间。它源于电子从激发单线态到基态的“允许跃迁”，过程迅速且高效。
• 磷光：寿命则长得多，可从1毫秒（ms）延伸至1秒（s）。其产生于电子从激发三线态到基态的“禁戒跃迁”，发生概率较低。

当然，也存在一些发光寿命介于数百纳秒到数百微秒之间的现象，它们可能兼具荧光和磷光的双重特性。在同等条件下，荧光的强度几乎总是显著高于磷光。为简化讨论，下文将主要围绕荧光检测展开，但其中大部分原理同样适用于磷光。

从定性鉴别到定量分析的挑战

荧光光谱被认为是一种“无背景”技术。理论上，如果样品本身不发光，测量信号的下限应为零。然而，其信号的上限却是不明确的。这使得建立一个独立于仪器几何构型和激发光强的通用荧光强度标尺变得异常困难。荧光信号的实际强度，受到激发光强度、吸收系数、样品浓度、量子产率、样品与仪器的几何构型以及探测系统响应等一系列复杂因素的共同影响。

这与吸收光谱法形成了鲜明对比。在吸收光谱法中，透射比是透过样品的光强与入射光强的比值，入射光强即为信号的上限。由于荧光强度标尺定义的内在困难，长期以来，研究人员很少尝试去比较不同仪器，甚至是同一台仪器在不同时期测得的荧光强度。因此，在很长一段时间里，荧光光谱的主要用途是进行定性分析，即判断未知样品中是否存在某种特定物质。即便用于定量，也依赖于特定仪器上绘制的“荧光强度-浓度”校准曲线，这种曲线不具备通用性，一旦更换仪器或参数，便宣告失效。

然而，近年来，随着荧光检测在许多关键领域的应用日益广泛，尤其是在需要遵循严格质量与法规标准的场景下，实现不同时间、不同仪器间荧光强度和光谱轮廓的可比性，已成为一个亟待解决的关键问题。

应用的拓展：从实验室到广阔市场

自20世纪50年代第一台商用荧光计问世以来，荧光法就以其探测低浓度物质的能力而著称。如今，利用荧光检测技术常规测量纳摩尔（nM）浓度的荧光团已是家常便饭，甚至在更苛刻的条件下可以实现单分子探测。

过去，由于自然界中能发光的化合物数量有限，荧光分析一度被局限于纯粹的科学研究。但在过去的10到15年间，情况发生了根本性的转变。化学家们合成了大量新型的荧光探针，这些探针经过精心设计，能够与种类繁多、数量庞大的待测物特异性结合。这一突破性进展，使得荧光检测从一种高灵敏度技术，一跃成为兼具高选择性的强大工具，其应用范围迅速扩展至广阔的商业领域。

灵敏度与选择性的强强联合，极大地推动了生物技术和药物发现在近年的飞速发展。荧光检测技术不仅被用于绘制人类基因组图谱，还广泛应用于蛋白质、病毒及活体生物基因的图谱构建。在制药行业，研究人员利用微孔板和微阵列技术，通过荧光法从组合化学库中高效筛选出有潜力的候选药物（drug “leads”）。在临床诊断中，流式细胞术结合荧光标记，可用于精确计数病变细胞或药物响应细胞的相对数量。此外，在环境监测领域，荧光检测同样扮演着重要角色，例如用于检测多环芳烃（PAHs）等污染物。

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仪器类型与样品测量

根据应用场景和性能要求，荧光光谱仪的形态各异：

• 传统台式荧光计：这类仪器通常配备氙灯等光源、用于选择激发波长的波长选择器（通常为200 nm至800 nm的单色器）、样品室以及用于收集发射光的波长选择器和检测器。对于液体样品（通常使用3-4 mL的比色皿），发射光通常在与激发光束成90°角的方向进行测量。对于固体样品，则通常在与激发光同侧、夹角小于90°的位置收集信号。

• 便携式荧光计：因其成本低、便于现场使用而日益普及。它们常使用光栅将荧光色散到线性电荷耦合器件（CCD）阵列探测器上，并利用光纤传输激发光和收集荧光信号。便携式仪器的发射波长范围很宽（200 nm至1100 nm），但其激发端通常使用灯、发光二极管（LED）或二极管激光器，且不设波长选择装置，因此其灵敏度和光谱分辨率通常低于台式仪器。

• 高通量荧光计：主要指微孔板和微阵列读板机，专为在短时间内测量大量样品而设计。其样品密度极高，例如在12.8 cm × 8.5 cm的微孔板上可集成1536个样品孔，在7.5 cm × 2.5 cm的微阵列芯片上可集成40000个检测点。微孔板读板机通常使用带通滤光片配合光源进行激发，而微阵列读板机则常用单色激光器。在发射端，通常使用带宽≥25 nm的滤光片进行波长选择。

通往可溯源的定量分析之路

要实现真正意义上的定量，简单的校准曲线是远远不够的。当荧光分析，特别是在临床诊断和药物质量保证等受监管领域，对定量精度的要求越来越高时，确保不同仪器和实验室之间的数据可比性就成了核心诉求。这就要求对荧光计进行严格的校准。实现跨仪器、跨实验室的数据可比性，对仪器进行严格的校准至关重要。这一过程不仅要求专业的知识，还需要标准化的设备与参照物。这正是专业检测实验室的核心价值所在。

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一套严谨的校准流程通常包含以下步骤：

1. 波长与带宽校准：对于配备单色器等波长选择装置的荧光计，首要任务是校准其激发和发射端的波长准确性与带宽。最常用的方法是在样品或光源位置使用原子灯进行校准。水的拉曼散射峰（斯托克斯位移为3382 cm^-1）也可用于在已知一个波长轴的情况下校准另一个。

2. 强度校准：接下来是对荧光强度随波长变化的函数（即光谱响应）进行校准。这可以分为相对校准和绝对校准。

   • 相对强度校准：旨在校正光谱的“形状”。可通过在样品位置放置已校准光源（用于校准发射端）或已校准探测器（用于校准激发端）来实现。
   • 绝对强度校准：目标是同时校正光谱的形状和绝对强度值。通常有两种实现路径：一是在样品位使用已校准探测器，再配合已校准反射器；二是在样品位使用已校准光源，再配合已校准反射器。

绝对校准最终会得出一个随波长变化的强度校正因子。利用该因子，我们可以从原始测量光谱中计算出样品的双谱 luminescence 辐射因子（BLRF）。BLRF被定义为样品的荧光辐射亮度与入射到样品上的激发辐照度之比，是激发波长和发射波长的函数。一个用BLRF单位表示的荧光光谱或强度值，是“绝对”的，因为它不再依赖于仪器，而只与样品自身的性质有关。

显然，如果能有提供相对强度或BLRF认证值的标准物质，将极大简化校准流程，使非专业人员也能轻松、经济地完成仪器校准。目前，全球多家国家级计量机构正在开发此类认证参考物质（CRMs）。但现阶段商业上唯一可得的此类标样是SRM 936a硫酸奎宁二水合物，它是一种相对强度标准品，有效覆盖了390 nm至590 nm的发射区域。